LI-6800測量新技術(shù)DAT | 你用400ppm/min來(lái)Ramp，就意味著(zhù)做整條A-Ci曲線(xiàn)，只需要4min

苑玲玲

苑玲玲，博士，2014年畢業(yè)于University of Nebraska-Lincoln，專(zhuān)業(yè)為Plant Breeding and Genetics。同年，加入LI-COR公司環(huán)境部，現為資深應用科學(xué)家。

你用400 ppm min^-1來(lái)Ramp，就意味著(zhù)做整條A-Ci曲線(xiàn)（例如從10ppm-1600ppm），只需要4min，這就大大縮短了測量時(shí)間【考慮到種內和種間差異，具體Ramp參數設置，請通過(guò)預實(shí)驗確定】。新技術(shù)顯著(zhù)縮短了測量耗時(shí)，極大提升了測量效率。

新技術(shù)和傳統方法得到的Vcmax、Jmax和二氧化碳補償點(diǎn)吻合度高。但是，傳統方法測量得到的原始數據點(diǎn)少，曲線(xiàn)擬合出來(lái)的參數具有更大的不確定性。除了A-Ci曲線(xiàn)，這項新技術(shù)也在調查類(lèi)測量（Survey Measurement）和光響應曲線(xiàn)測量（A-Q Curve）方面做了驗證。 

LI-COR 苑玲玲：LI-6800測量新技術(shù)DAT.mp3

A new technique for gas exchange measurements: Dynamic Assimilation^TM

2021.10.16 武漢

各位老師同學(xué)，大家好！今天給大家介紹一項用于葉片氣體交換測量的新技術(shù)。

叫做Dynamic Assimilation^TM，或者是叫Dynamic Assimilation^TM Technique。首字母的縮寫(xiě)就是DAT（動(dòng)態(tài)吸收測量技術(shù)）。

首先我們簡(jiǎn)要回顧一下氣體交換測量的歷史，之后我會(huì )給大家介紹目前所使用的測量技術(shù)，然后我會(huì )重點(diǎn)談一下DAT。

世界人口的急劇增長(cháng)使得人們對于糧食和能源的要求不斷增大，這就刺激了光合作用的研究。而對于光合作用研究的需求，又推動(dòng)了相關(guān)儀器和測量技術(shù)的發(fā)展。

回顧歷史，100年前，大約是在1920年左右的時(shí)候，研究人員通過(guò)化學(xué)試劑滴定的方法來(lái)測量葉片對于CO₂的吸收，作為評估葉片光合能力的指標。核心原理就是利用CO₂與氫氧化鋇產(chǎn)生碳酸鋇沉淀，然后用酸來(lái)滴定中和，通過(guò)對比空白組所需酸的量的差別來(lái)計算葉片對于CO₂的吸收。

人工搭建的這個(gè)設備，大家可以看到這張圖，操作起來(lái)費時(shí)費力，這張圖顯示了當時(shí)所用的設備。圖片出自下面這篇paper，引用過(guò)來(lái)的。這張圖顯示的就是通過(guò)這種滴定方法測得的一天中甘蔗葉片對于CO₂吸收的日變化。

到了上個(gè)世紀四五十年代，紅外線(xiàn)氣體分析儀逐漸發(fā)展了起來(lái)，人們便開(kāi)始把這個(gè)紅外線(xiàn)氣體分析儀用在光合測量設備里面。

當時(shí)很多設備因為體積龐大、操作繁瑣，基本只能在室內使用。但是因為大家對戶(hù)外測量是很有需求的，所以一些可移動(dòng)的設備也被研發(fā)出來(lái)，如像這個(gè)Slide右手邊這種。

到了上個(gè)世紀八十年代、九十年代的時(shí)候，LI-COR公司研發(fā)的LI-6200、LI-6400相繼問(wèn)世，可以說(shuō)是拎起來(lái)就走，之后更先進(jìn)的LI-6800問(wèn)世，那就更方便了，操作直觀(guān)，自動(dòng)化控制。

回顧歷史，我們可以看到，人們對于光合測量設備的不斷追求，為光合研究提供了新工具。

現在市面上的氣體交換測量系統，一般都是采用開(kāi)路式的方法、開(kāi)放式氣路（進(jìn)行測量）。

所謂開(kāi)放式氣路，顧名思義是指非封閉。氣流持續的有進(jìn)有出。對LI-6800來(lái)說(shuō)，外界的空氣進(jìn)入主機，水汽、CO₂濃度被調適以后，出來(lái)，進(jìn)入分析器。分流，一路不接觸葉片直接被測量，叫做Reference，作為對照。另外一路經(jīng)過(guò)葉片，然后被測量，叫做Sample，最后氣流排到外界。Anyway，就是說(shuō)氣流有進(jìn)有出，這是一個(gè)開(kāi)放式氣路。那么在葉片所在的這個(gè)位置，就是葉室這個(gè)地方，具體發(fā)生了什么呢？

這個(gè)長(cháng)方形代表整個(gè)葉室部分，氣流流經(jīng)葉室，進(jìn)氣流速為u1，進(jìn)氣流中CO₂濃度為c1,水汽濃度為w1，出葉室的CO₂濃度_c2，水汽濃度_w2，這些指標都會(huì )被儀器直接測量記錄。由于葉片的光合作用吸收CO₂，蒸騰作用釋放水汽，這就是所謂的氣體交換，使得_c1和_c2之間，_w1和_w2之間存在差值，這個(gè)差值用于計算CO₂同化速率和蒸騰速率。

在這個(gè)公式里，A代表CO₂同化速率，E代表蒸騰速率，s代表葉面積?；趯@個(gè)氣流水汽和CO₂濃度的測量，蒸騰速率和CO₂同化速率就用這兩個(gè)公式計算出來(lái)。這里需要注意的一點(diǎn)是，這兩個(gè)公式是基于“Steady State”，或者說(shuō)是穩定狀態(tài)。長(cháng)久以來(lái)，開(kāi)路式氣體交換測量，都是依賴(lài)于“Steady State”。

那你可能要問(wèn)了，什么叫“Steady State”呢？它是指葉室情況穩定，達到一個(gè)穩定狀態(tài)，就是說(shuō)CO₂，_c1和_c2達到一個(gè)恒定值，水汽w1和w2達到一個(gè)恒定值，氣流_u1和_u2也要達到一個(gè)恒定狀態(tài)。

一旦不穩定，用這個(gè)公式計算出來(lái)的CO₂同化速率就是不對的了。比如說(shuō)，當葉室是空的、關(guān)閉的，沒(méi)有葉片的時(shí)候，測得的CO₂的同化速率應該是零，對吧。因為沒(méi)有葉片，不管你的CO₂濃度控制是多少，或者怎樣變化，光合值應該都為零，但是市面上光合儀的表現，卻不是這樣。

大家會(huì )經(jīng)常注意到，如果你改變CO₂濃度，比如像左邊這張圖，CO₂控制從400ppm到600ppm，您能看到光合值突然有很大的波動(dòng)，然后再逐漸的回歸到零。

這就意味著(zhù)，在記錄數據的時(shí)候，你需要等待，需要等待葉室又重新達到一個(gè)新的Steady State后，才能記錄數據。大家能看到，這兩張圖中，前30秒的階段是一個(gè)Steady state，大概70s以后，也是一個(gè)Steady state，從30s到70s之間，是一個(gè)Non-steady state，就是一個(gè)非穩定狀態(tài)。

如果您在Non-steady state階段記錄數據，那您的數據就是不對的。

那有沒(méi)有一個(gè)方法可以實(shí)現更快的氣體交換測量呢？

幾年前，LI-COR聯(lián)合The University of New Mexico的研究人員，推出了一項新技術(shù)叫做RACiR^TM，RACiR^TM用于CO₂響應曲線(xiàn)的測量。它是通過(guò)Ramp CO₂濃度（連續降低或升高CO₂的濃度），像左邊這張圖，之后通過(guò)空葉室校正來(lái)得到最終的數據。RACiR^TM讓使用者可以更快的測量A-Ci曲線(xiàn)，進(jìn)而得到Vcmax等參數，這讓快速篩選成為可能。

另外由于CO₂是連續變化的，儀器在連續的快速記錄數據，因此能獲得大量的數據點(diǎn)。大量的數據點(diǎn)，對于A(yíng)-Ci曲線(xiàn)的擬合是大有幫助的。但RACiR^TM是有局限性的，只能用于A(yíng)-Ci曲線(xiàn)的測量，不能用于其他類(lèi)型的測量，如調查式測量（Survey Measurement）或光響應曲線(xiàn)的測量（A-Q Curve）。

另外RACiR^TM所用的這個(gè)CO₂ Ramp Rate，不能太快，局限于100ppm/min。另外RACiR^TM需要空葉室校正過(guò)程。測量數據的準確性，依賴(lài)于空葉室校正的數據準確性。

那有沒(méi)有一項技術(shù)，可以突破RACiR^TM的這種局限呢？比如說(shuō)CO₂ Ramp rate能不能更快一些? 除了A-Ci曲線(xiàn)的測量，可不可以應用到其他類(lèi)型的測量上呢？

下面我就用一些Slides，來(lái)講一講由LI-COR研發(fā)并成功應用到LI-6800的這項新技術(shù)。

其實(shí)對于開(kāi)放式測量系統，它的Fundamental質(zhì)量平衡公式是這個(gè)，相比之前的Slide，這個(gè)公式里多了一項，就是這個(gè)dc/dt。這個(gè)公式很好理解，這個(gè)_u1c1，代表了有多少CO₂進(jìn)入了葉室，_u2c2是多少CO₂離開(kāi)了葉室，SA這一項是多少CO₂被吸收，這個(gè)dc/dt就是葉室內的CO₂濃度隨時(shí)間的變化。

在Steady State的情況下，dc/dt為零。就是說(shuō)葉室內的CO₂濃度隨時(shí)間是不變的。當dc/dt=0時(shí)，通過(guò)推導，你能看到這個(gè)A值，就是在Steady State下使用的公式。

所以，Steady State下使用的公式是Fundamental質(zhì)量平衡方程的一種特殊狀態(tài)，即dc/dt=0。

那么不在Steady State的情況下，或者說(shuō)dc/dt不等于0的情況下，這個(gè)等式就是一個(gè)Dynamic質(zhì)量平衡方程。在這種情況下，你把A值推導出來(lái)，就是右邊這個(gè)公式。這個(gè)公式可以說(shuō)是Dynamic Assimilation^TM Technique（動(dòng)態(tài)吸收測量技術(shù)）的核心公式。

因為L(cháng)I-6800的獨特性，比如說(shuō)，快速精準連續的環(huán)境條件控制、葉室緊靠分析儀，以及Range Match功能，使得Dynamic Assimilation^TM Technique（動(dòng)態(tài)吸收測量技術(shù)）這項新技術(shù)可以整合進(jìn)LI-6800系統。這項新技術(shù)已經(jīng)申請了專(zhuān)利保護。

經(jīng)驗證，這項新技術(shù)優(yōu)于傳統的Steady State的測量方法以及RACiR^TM。

我們做空葉室實(shí)驗，就是用關(guān)閉的空葉室，CO₂的同化速率A應該為零。當CO₂濃度改變后，比如CO₂濃度從400ppm提升到600ppm，基于Steady State的技術(shù)測量的數據點(diǎn)是右圖中紅色的Curve，能看到，CO₂同化速率A會(huì )有一個(gè)大的波動(dòng)，等待一段時(shí)間（約40s）后，才會(huì )重新回到零。

基于這項新技術(shù)，CO₂同化速率A，也就是這個(gè)藍色的Curve，只有一個(gè)小小的波動(dòng)，并且很快（約5s）就回到了零。這意味著(zhù)，在測量葉片的時(shí)候，等待的時(shí)間會(huì )大幅減少。

這張Slide，同樣是空葉室實(shí)驗，沒(méi)有葉片，CO₂濃度從0ppm改變到1600ppm，連續變化的整個(gè)過(guò)程中，大家看到，這個(gè)藍色的Curve，是使用新技術(shù)Dynamic Assimilation^TM Technique（動(dòng)態(tài)吸收測量技術(shù)）測量得到的凈光合速率A，整個(gè)過(guò)程一直保持在0附近。但是傳統的測量方法，A值會(huì )有很長(cháng)一段時(shí)間（約500s）的升高，當CO₂穩定以后，傳統測量方法得到的A值才會(huì )重新回到0。 

除了在空葉室的驗證，以下這些Slides通過(guò)真實(shí)的測量葉片來(lái)驗證這項新技術(shù)的優(yōu)勢。

下面左邊這張圖比對了三種不同的方法，做的A-Ci響應曲線(xiàn)，其中，藍色、紅色代表是Dynamic Assimilation^TM Technique（動(dòng)態(tài)吸收測量技術(shù)），黃色代表的是RACiR^TM，紫色的方塊和紅色的×是傳統方法所測量的A-Ci響應曲線(xiàn)。大家能看到這些結果是基本吻合的，DAT #1和#2有什么區別呢？CO₂ Ramp速率是不一樣的，#1是200ppm/min, #2是400ppm/min。實(shí)驗樣品是向日葵葉片。大家可以看到，對于向日葵葉片來(lái)說(shuō)，兩個(gè)Ramp速率，結果差別很小。

你用400ppm/min來(lái)Ramp，就意味著(zhù)做整條A-Ci曲線(xiàn)（10ppm-1600ppm），只需要4min，這就大大縮短了測量時(shí)間。傳統測量方法，一條A-Ci響應曲線(xiàn)需要~30min。右邊這張圖就是Curve起始階段放大后的圖，大家可以看到，新技術(shù)和傳統方法得到Vcmax、Jmax和二氧化碳補償點(diǎn)是基本吻合的。但是，傳統方法測量得到的數據點(diǎn)少，曲線(xiàn)出來(lái)的參數具有更高的不確定性。那除了A-Ci曲線(xiàn)，這項新技術(shù)也在調查類(lèi)測量方面做了驗證，并且有明顯的優(yōu)勢。

下面這個(gè)實(shí)驗是調查式測量，一開(kāi)始這個(gè)葉室為關(guān)閉狀態(tài)，空葉室CO₂R和CO₂S都是穩定的，起始階段CO₂同化速率A也是穩定的。然后在這個(gè)時(shí)間點(diǎn)，葉室被打開(kāi)，打開(kāi)以后夾上葉片，關(guān)閉葉室，葉片之前做過(guò)光適應，藍線(xiàn)是用新技術(shù)測量得到的CO₂同化速率，紅色是傳統方法測量得到的CO₂同化速率，可以明顯的看到，這個(gè)新技術(shù)回到穩定狀態(tài)更快。最右邊這張圖就是畫(huà)圈部分的放大圖，傳統方法滯后約20-30s。

另外，這項新技術(shù)也能用于光響應曲線(xiàn)（A-Q Curve）的測量。由于植物響應光強變化要慢于CO₂的變化，使用這項新技術(shù)做光響應曲線(xiàn)測量時(shí)，光強的Ramp rate不能太快，因此完成光響應曲線(xiàn)所需要的時(shí)間與傳統的常規方法是接近的。新技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是數據點(diǎn)多，有助于更準確的曲線(xiàn)擬合。

總結一下，Dynamic Assimilation^TM（動(dòng)態(tài)吸收測量技術(shù)）在三種重要的測量類(lèi)型中，都可以應用，尤其是在A(yíng)-Ci曲線(xiàn)測量和調查類(lèi)測量中，新技術(shù)顯著(zhù)提高了測量速度，密集的數據點(diǎn)有助于曲線(xiàn)擬合；在光響應曲線(xiàn)（A-Q Curve）的測量中，優(yōu)勢體現在密集的數據采樣上。 

這項新技術(shù)是由LI-COR的兩位科學(xué)家Aaron J Saathoff和Jon Welles共同開(kāi)發(fā)，并成功整合應用到了LI-6800里面。關(guān)于這項新技術(shù)的文章，兩個(gè)月前發(fā)表在Plant Cell& Environment雜志上，題目是Gas exchange measurements in the unsteady state（doi.org/10.1111/pce.14178）。這篇文章是Open Access的，大家感興趣的可以找來(lái)讀一下。好，今天我的報告就到這里，謝謝大家。

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